در اواخر دهه 1980، به عنوان پیشرفته، میکروسکوپ کانفوکال لیزری یک نقص عمده دارد: دیافراگم کانفوکال نه تنها فلورسانس تولید شده در خارج از نقطه کانونی را مسدود می کند، بلکه فلورسانس تولید شده توسط نقطه کانونی را که توسط بافت های بیولوژیکی پراکنده شده است، مسدود می کند. منجر به کاهش راندمان جمع آوری فلورسانس می شود و عمق تصویربرداری نمی تواند بیش از 100 میکرومتر باشد. بنابراین، در دهه 1990، میکروسکوپ فلورسانس دو فوتونی ترکیبی از میکروسکوپ کانفوکال لیزری و فناوری تحریک دو فوتونی به وجود آمد. طول موج تحریک فرآیند جذب دو فوتون عموماً در محدوده پنجره بیواپتیکی 680-1080 نانومتر تنظیم میشود که از آسیب نور ماوراء بنفش به سلولها یا موجودات زنده جلوگیری میکند و به عمق بیشتری نفوذ میکند.
در حال حاضر پرکاربردترین میکروسکوپ فلورسانس دو فوتونی لیزر سنگ قیمتی تیتانیوم فمتوثانیومی است که حجیم و گران است که کاربرد میکروسکوپ فلورسانس دو فوتونی را در زمینه های مختلف مانند علوم زیستی، شیمی و پزشکی محدود می کند. بنابراین در برخی از زمینه ها مانند تشخیص پزشکی، مردم سعی کرده اند از لیزرهای حالت جامد زیر نانوثانیه ای فشرده و مقرون به صرفه به عنوان منبع نور استاندارد استفاده کنند.
اصل اساسی تحریک دو فوتونی این است که وقتی یک مولکول فلورسنت تحت چگالی فوتون بالا برانگیخته می شود، به طور همزمان دو فوتون با طول موج بلند را جذب می کند و سپس به طور خود به خود فوتون های فلورسنت را پس از جهش های تحریک و فرآیندهای شل شدن به حالت پایه بازتاب می دهد. در مقایسه با میکروسکوپ فلورسانس تحریک تک فوتون معمولی، تولید سیگنال نوری در میکروسکوپ فلورسانس تحریک دو فوتونی غیرخطی است، به طوری که نور تحریک یک منبع نوری با طول موج بلندتر و با حداکثر قدرت بالاتر است و فوتون های فلورسنت ساطع شده دارای طول موج هستند. کمی بیشتر از نیمی از طول موج تحریک.
میکروسکوپ فلورسانس دو فوتونی از یک منبع نور لیزر نزدیک به فروسرخ استفاده می کند و ماهیت غیرخطی آن نیازی به دیافراگم کانفوکال ندارد. بنابراین، در مقایسه با میکروسکوپ کانفوکال، میکروسکوپ فلورسانس دو فوتون دارای مزایای زیر است:
- عمق تصویربرداری زیاد و آسیب نوری کم؛
- هیچ دیافراگم کانفوکال مورد نیاز نیست و راندمان جمع آوری فلورسانس تا حد زیادی بهبود یافته است.
- وضوح و کنتراست فضایی بالاتر؛
- محدوده تحریک کوچک، سمیت نوری کوچک و سفید کننده.
- طول موج انتشار و تحریک از هم دور هستند و از همپوشانی طیفی جلوگیری می کنند.
